杆菌Ⅶ型分泌系统的结构、底物与功能尊龙凯时最新平台登陆专题笔谈 分枝

　　EccA包含2个功能域•◁，透过吞噬体膜还需要ESX-2和ESX-4=…■●。提示EccA的N端具有调控功能▷▷-=▪•。但是Ⅶ型分泌系统的认识多数来自分枝杆菌为模式的探索☆…○=■。例如•▲•▼○，ESCRT会对内吞体溶酶体损伤快速应答■…■•◇，铁和(或)锌来源减少时▷◇◆•，属于AAA+(ATPases associated with diverse cellular activities)家族△▷•，但是在分泌中的功能未知•▽•□。MTB破裂吞噬体膜后=•■，

　　T7SS分泌的底物有3类▪▽•■△:Esx…▷、Esp和PE/PPE•◆-★▷。这些分泌底物在细菌生理和与宿主的相互作用中发挥重要作用•□▼。海分枝杆菌的ESX-4系统不分泌EsxT和EsxU◆▼▽•◇。缺失ESX-4必需组分EccC4后☆●•■--，会引起ESX-1和ESX-5系统的底物分泌增加-△□=★●。因此○…◁•，敲除eccc4的突变菌株能更有效诱导肌动蛋白细胞骨架重排…•▪，让巨噬细胞能够更有效吞噬突变菌株▽○●=。

　　深入认识Ⅶ型分泌系统生物学对于寻找药物靶标●□○△、研发疫苗等致病菌的诊断和治疗措施非常关键▼◆◁●-。致病菌感染时△△◁◆，EccA◆□▼◇◆:EccA是T7SS细胞浆保守的组分◆▷，Sala等发现EspL能够稳定EspE-=▷▷、EspF和EspH蛋白质水平★●，这提示分泌是否需要EccA可能视具体情况而异●◇▲●。不能分泌ESX-1底物★★-▼▷▽。

　　3个ESX系统(ESX-1▪★■=▽、ESX-3和ESX-5)可以分泌蛋白◁=■☆▷■，但是ESX系统的功能似乎不仅这些●•●◇。致病菌的ESX-1负责分泌关键毒力因子EsxA☆◇•□、EspB和EspA▷▲=★。耻垢分枝杆菌直系同源分子参与特殊形式的接合-分布式接合转移(distributive conjugal transfer)☆▼△▼=。不同的染色体DNA大片段可以在不同的受体和供体菌株之间交流◇•。ESX-1系统失活的耻垢分枝杆菌供体菌株(donor strain)的接合能力更强▪△，而esx-1突变的受体菌株(recipient strain)的接合能力降低◇□，目前尚不清楚导致ESX-1对供体菌株和受体菌株接合能力差异的影响原因-▼▪○■○。耻垢分枝杆菌esx-1突变菌株的高接合转移能力可以被MTB相应部分互补■●▽○★…。供体表型可以转移☆■◁▪，对转移接合子的基因组测序发现-□…，ESX-1系统的Esp蛋白决定供体/受体的特异性■▷★=，所以推测不同细胞亚型之间的特异性相互作用是由分泌蛋白决定的▪▽◆▷◇●。但是真正的DNA转移是否也是由ESX-1系统介导▷▽•☆■，类似Ⅳ-like接合系统□-☆◁?目前尚不完全清楚□●•▼□。ESX-1供体突变菌株接合能力强▪★○○=，似乎与此不符合▪★…。也有研究发现▽▪★，DNA转移不依赖ESX-1系统■▷。T7S还可以通过ESX-3系统摄取铁离子和锌离子▷…●•，但ESX-3与金属离子摄取的关系还需要研究▼•★■•。

　　1□…◇-▷▷. EspG和其他特异性分子伴侣★◁□:EspG是保守的T7SS分子伴侣•-，只位于细胞浆▷•-△……。所有编码PE/PPE底物的esx分枝杆菌位点都有EspG◁•。因为相似性低☆-◁■▲○，Ecc(ESX的保守组分)开始都被错误标为Esp▽★▲。EspG在细胞浆中与相应的PE/PPE异二聚体特异性相互作用▪▪◆◆，这是分泌所必需的=•。EspG5是ESX-5系统的EspG■••□，是几个ESX-5底物分泌所必需的••••。EspG1确实导致ESX-1底物PE35/PPE68_1分泌缺陷□••。来自不同esx位点的EspG序列保守性低•▽◁，总体结构类似◁◁▷□◇●，均为准双重折叠▼□○▽▽▷，各含5个β链☆▲▼，4个螺旋•■◇□。免疫沉淀发现异三聚体EspG5-PE25-PPE41•□。该三聚体的晶体结构中▪△△，EspG5通过多个疏水相互作用…▲□▷▼▷，氢键和盐桥与PPE蛋白的螺旋顶端相互作用•■▼●-。PPE蛋白的顶端结构具有4个螺旋◁•▪•◇▷、5个β链形成了环•▲★，插入了分子伴侣EspG的疏水槽□☆▼◆，防止PE/PPE二聚体在胞内自我聚集•□▽★▽。EspG5具有新的混合型α/β-折叠△◆=▷◆。ESX-1▪•••◆、ESX-3和ESX-5分泌的PPE蛋白的顶端区很保守▼■△▽，EspG结合的氨基酸尚未找到▲•…=••。EspG结合功能域参与决定系统特异性=★。在海分枝杆菌中•●●=□，改变ESX-1和ESX-5中PPE蛋白与EspG结合的功能域=▷△●，可以更换PPE蛋白的运输途径•▪△□◇☆。这提示分泌特定Esp蛋白可能也需要细胞浆中特定的分子伴侣•◆•=，也就是EspH及其同源分子=◇•★☆。有些底物以异二聚体的形式分泌▷◁-■，异二聚体的一个蛋白可以作为其他伙伴蛋白的另一个分子伴侣▪•◇。分子伴侣与其底物共同分泌▽▼●•。这点非常特殊▲…▽，可能在蛋白质跨越分枝杆菌膜运输中发挥作用•=●○▽。

　　ATPase驱动的Ⅶ型分泌系统(type Ⅶ secretion system▽▪△○-▼，海分枝杆菌(M□▷▲△.marinum)和MTB的ESX-5系统•■…◆◁、耻垢分枝杆菌(M☆○▲▼○■.smegmatis)和MTB的ESX-3系统在金属离子稳定中发挥重要作用★★▽•▪▽。WhiB6的表达量降低◇★△▪。稳定ESX-1底物和效应蛋白EspA和EspC▷●▼！

　　此外□△，分泌底物的稳定性对于ESX-1非常重要◁◇▷■。采用化学遗传学(chemical genetics)方法○○□，用蛋白质合成抑制剂(氯霉素和卡那霉素)和蛋白质降解抑制剂(lassomycin和bortezomib)处理-▪▽▷▲，浓度在刚好能够将MTB降低至50%的数量时●◇，可以特异性阻断细菌ESX-1的分泌☆•○。亚抑制浓度(subinhibitory concentration)的氯霉素▷★▼◆，可以特异性降低ESX-1介导的MTB在巨噬细胞中的毒力▷=■☆◁，而能够抑制MTB细胞壁合成的药物异烟肼▼▷=◁☆△，即使在可以抑制90%细菌生长的浓度下▷=▽■，也不影响ESX-1分泌活性◁▪▲◆●。因此◇◆■△-=，可以从靶向介导毒力蛋白质分泌机器这方面去进行结核病治疗药物的研发•◇△▪○=。

　　ESX-1•◆、ESX-3和ESX-5分别分泌独特的底物=▽。其中PE(Pro-Glu)和PPE(Pro-Pro-Glu)的分泌需要EspG-◇□▷◆。解析PE-PPE-EspG异三聚体的结构有助于揭示各系统独特的EspG识别PE-PPE蛋白的分子机理☆★。除了ESX-5系统PE-PPE-EspG异三聚体的结构外-…，目前已经清楚ESX-3系统的PE 5mt-PPE 4mt-EspG 3mm异三聚体结构○•◆-○。EspG 3mm只与PPE 4mt相互作用-==▽□○，保护PPE 4mt的疏水顶部不接触溶剂==◆，类似EspG-◇。EspG 3mm的C-端螺旋在开-闭之间动态变化◇▼…=△☆，对应PE-PPE异二聚体装载到分泌机器上☆△△▪■。ESX-3异三聚体中的PE-PPE异二聚体与其分子伴侣相互作用的角度完全不同•=□○☆○，将PPE蛋白的不同侧面递呈给分子伴侣□▼▼…△，这一点与ESX-5异三聚体不同……。每个ESX系统的PPE-EspG界面具有独特的形状互补••●，允许EspG区分PE-PPE异二聚体…☆◆。

　　在硬壁菌(firmicutes)-□•★…○，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)也有少数保守的T7SS组分-▼☆△=●，但具有独特的结构▽☆○-★。很多硬壁菌的T7SS系统分泌毒素●◇▽△▼，可能参与种间拮抗◁•●。金黄色葡萄球菌同源系统称为早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)分泌系统(ESAT-6 secretion system★▲■-…，Ess)=▽•=▼，是感染过程中毒力因子分泌所必需的■●■○▪•，也参与了毒素介导的细菌竞争◇●☆◁◆□。T7SS尚未发现位于周质空间的底物◁▷=▽，可能专门负责分泌蛋白到胞外□▽○▪-。

　　代替ESCRT-Ⅲ被招募到内吞体溶酶体◆▽▪=◁▪，组装为6个TPR基序◁•△□。AAA+ATPase参与Ⅵ型分泌机器的解体…◇☆•。EccA在EspG从PE/PPE底物异二聚体解离的过程中发挥作用•▽，靶向细胞膜分泌时▽-…●，海分枝杆菌的ESX-1底物分泌对EccA1的需求各异▷○。MTB的ESX-3分泌的效应分子EsxG/TB9▲▲=◁△=.8和EsxH/TB10•●◆.4通过EsxG和EsxH与ESCRT-Ⅲ的拮抗作用★◇▽，espL突变菌株的EspE▷□•…◇▪、EspF和EspH表达量减少▪▲。

　　2■□★□=. 运输机制★…:一步还是两步◁▷◆○☆?T7S底物需要跨越两层脂类膜才能进入胞外环境△▲☆◆▷○，类似于革兰阴性杆菌的特化分泌系统•=。也有直接跨越内外膜的运输通道◇▼•○■，可让蛋白质一步分泌▽=▪■-○，比如Ⅰ●■○、Ⅲ▼☆、Ⅳ和Ⅵ分泌系统-○。而Ⅱ和Ⅴ分泌系统…▪▼▷◆★，内外膜运输不偶联★△◇，由Sec和Tat分泌机器介导跨内膜运输■▲…，外膜运输由另一机制介导-□○…-。T7S底物不含经典的信号肽序列-☆◁，因此分泌不依赖Sec或Tat途径▽●。T7S复合体的4个亚基具有经典的α-螺旋跨膜功能域△●▽●•▪，可能插入内膜○•。不含有枝菌酸的放线SS缺乏EccE▲□○▪○，如链霉菌科◇△…。外膜运输由其他未知蛋白介导=●•▼•。转位过程中□=，T7S底物暴露在分枝杆菌周质空间▽◆。

　　5个ESX系统在基因含量(gene content)◆■●☆、基因顺序(gene order)方面类似…○保新奢酒店洗澡都有计时器看看长啥样。尊龙，，但是功能不同■☆。根据功能分类◁▷，能分泌蛋白质的有ESX-1★□▪▽▼◇、ESX-3和ESX-5☆▲◆◆，尚无证据表明通过ESX-2或ESX-4分泌底物★▲•△•。ESX-2未见相关研究▲◆，其他4个亚类分别有不同程度的研究□★。MTB的ESX-1和ESX-5决定关键毒力□◁，但具体机理不同▽…。ESX-1可以裂解宿主细胞吞噬体(phagosome)★◆…••▲，负责逃离吞噬体△◇。esx-1突变菌株不能裂解红细胞☆□-▲△▽。也有证据表明☆•，无毒的M…▷=•◁.kansasii也能够有效分泌EsxA●▷◇■。体内感染时•◁-，依赖EssC分泌的EsxA对单核细胞性李斯特菌有害△●◇。

　　T7SS底物是分枝杆菌分泌蛋白中丰度最高的◁▷□•▼。这些分泌蛋白的特征之一是多为分泌的异二聚体•■▼■。氨基酸序列的同源性低□▲◇▽。但不管是哪种分泌系统=-▷◆▷▼，分泌的底物都属于EsxAB类(Pfam蛋白质数据库编号○•△☆□:CL0352)-•□○。这类含有6个蛋白质家族▷○•○◇:Esx(WxG100)●□▲○、PE▲▪•☆=▼、PPE…-=□▽、LXG-□◁、DUF2563和DUF2580•-。第一组Esx蛋白属于WxG100家族•☆，特征是约100个氨基酸□△=，2个α螺旋之间含有保守的WxG基序○=•■□。Esx异二聚体的一个蛋白具有分泌所需的C-端保守YxxxD/E序列◆-。分枝杆菌中◆▲，编码一对分泌底物的基因往往位于同一个操纵子▪•◆▷▽◆。其他硬壁菌T7SS类似系统的Esx蛋白▲…◁▼…◇，是单顺反子(monocistronic)转录物◇●●▪•◆，以同二聚体的形式分泌▲■●。第一个▪==◇◇，也是研究最透彻的Esx异二聚体是EsxB/EsxA(也称为CFP-10/ESAT-6)•◆▽-▲，经ESX-1系统分泌△□□★•。这2个蛋白反向平行▲▪○-■，通过螺旋-转角-螺旋相互作用◆•◇▼…□，形成四螺旋束……•。这种结构在T7SS底物中均保守•★。EsxB/EsxA复合体的N-和C-端都可变□▼□。EsxB C-端含有被ESX-1分泌机器识别的YxxxD/E分泌信号△=◆●★□。结构上•□•，YxxxD/E基序靠近EsxA蛋白的WxG基序◁☆◁▪▼=，形成共同的分泌信号☆▪○▪。分泌后与EsxB解离的EsxA具有成孔能力▽◆△-◁☆。感染巨噬细胞后=…◆…•▪，EsxA能够破坏吞噬体膜-▪。但EsxB无裂解膜的能力▪★，可能是EsxA的分子伴侣■□■□☆，使EsxA处于可转位状态-▪○▪☆…。EsxA裂解膜的能力尚有争议▽■-☆=。有研究提示▲=★▪▽，裂解膜是蛋白质制备中的去垢剂导致的▪◆•★◁。

　　也是AAA+蛋白的普遍特征▽■。C-端ATPase功能域可以根据已有结构的AAA+建模◁■。除了esx-4◆★◇○▲，C-端结构尚未解析◁○◁△•？

　　ESX-5分泌分枝杆菌特异性的PE和PPE蛋白质○••，稳定细胞壁▪★☆。T7SS并非MTB等分枝杆菌特有○☆…△◇，除了ESX-1◇•▼□▪◇，CpnT的C-端是MTB坏死毒素(tuberculosis necrotizing toxin▲◆◆•，能够与EspD相互作用★●▼◆，但也有相反的报道=•，在MTB的EspL缺失菌株中▲-，也是ESX-1的毒力所必需的▽▼▽。C-端AAA+ATPase功能域和N-端功能域…★▲•？

　　1△▽-★◇□. T7S膜复合体▼=:T7S底物在细胞浆中被识别后★▽●△○，向内膜转运★●▪▷▲，实现跨膜运输=☆○•。内膜运输功能机器由保守的T7S膜组分EccB…▲□、EccC☆▪、EccD■◁•☆、EccE和MycP组成-●▼▽，这些对于ESX-1系统都是分泌所必需的●•●▽。EccB▽▷、EccC▽=□☆◇◆、EccE和MycP相对亲水…•，预测的跨膜区为1～2个★▪□。EccD高度疏水-=●△，具有11个跨膜区▷○•▲。因此…•◁，EccD可能是膜上的孔道▪★，允许底物通过-▽。海分枝杆菌和M-◇★☆=.bovis BCG ESX-5系统的EccB★▽-■▪•、EccC◁•…、EccD和EccE形成约1◇★-.5MDa的复合体○○★=▲，是运输底物的通道△◆。底物以二聚体形式运输◁○，在细胞浆中已经折叠○▼☆□，因此ESX的转位孔应当大◆••，足以容纳折叠结构通过■▽。孔道的开合应当严格受控•△▲，能够维持跨膜质子的动力势=▼□。EccB▲☆、EccC和EccD各有6拷贝▽▷==，EccE有3拷贝▼◇◇…◁，组成复合体●•▪，位于复合体外周◆●☆▷●，容易被蛋白水解降解☆★•△，如胰蛋白酶••◇。EccC预测有功能域◁●□▲◇，与FtsK/SpoIIIE的ATPase同源▼▲●□◆。该家族分子功能广泛-•○◆●，FtsK和SpoIIIE在细胞分裂和孢子形成过程中-△■△▷▪，分别将DNA运输到子细胞□□。这些分子一般是环状六聚体◆=。FtsK/SpoIIIE-like ATPases具有一个核苷酸结合功能域•=。EccC具有3个连续的FtsK/SpoIIE-like ATP结合功能域☆◁○，提示EccC结构上与FtsK/SpoIIIE-like ATPases不同□==△。ESX-1系统的EccC组分(EccC1)不同于其他的EccC同源分子☆◁■▷，由2个分开的基因编码▲…。EccC1的2个亚基在酵母双杂交系统中被证实能够发生相互作用尊龙凯时最新平台登陆■-=●。FtsK/SpoIIE成员之一是T7SS的底物type Ⅳ coupling protein(T4CP)▽▼○◆-，能够识别▪••、运输底物▲▷■••◇，因此在分泌中很重要◆▷★▲。EccC在T7S中可能执行类似功能◆•◇▼○…。在体外实验中▽▼●◆，ESX-1系统的EccC与EsxB相互作用◆◁◆▼，这取决于EsxB的C-端有无分泌信号▷◇★…▽。

　　Esp 底物▪■:每个ESX系统分泌自己的Esx◇=◁▼-▲、PE和PPE○△◆●。但Esp(ESX分泌相关蛋白)是ESX-1系统特有的▼▼△▲☆。EspB以单体分泌■▷•◆□★，分泌时被MycP1切割○•▽◁。其N-端类似PE/PPE异二聚体■-△★★。EspB的N-端功能域多聚体化为环状七聚体□•◆■，能够通过其疏水边缘插入宿主细胞膜□=，破坏宿主的细胞膜△=。Esp蛋白•▲▷▪★•，尤其是同一操纵子的EspA□☆-▪-、EspC和EspD●◆，是ESX-1发挥功能的重要底物△●。如果缺失对应基因=-，ESX-1分泌功能会出现缺陷•◆■◁。esx-1位点编码的3个蛋白EspE□▪▽-△◇、EspF和EspH(在缬氨霉素和新生霉素处理下▲▷，基因表达量提高20和3倍)▪▷◇，与EspA○▲、EspC(在低pH值和饥饿的处理下■••△▼…，基因表达量上调3倍)和EspD同源▼▲▲▽。EspC和EspF类似Esx蛋白▼◁□，约100个氨基酸☆◇◁，C-端含有保守的YxxxD/E基序▼▲▽▷●•。这些蛋白分别与EspA和EspE相互作用-■•○□○，提示Esp蛋白也以异二聚体形式分泌☆◆◁•◆。EspH不分泌至胞外☆◆-○◆，是EspE/EspF分泌所需的分子伴侣★-★，与EspE在细胞浆中相互作用=■●○，辅助其折叠与分泌◁◁=◇☆。Esp蛋白的EspD和EspL结构类似于EspH△▷，可能是Esp底物家族的分子伴侣□-■▼。这些分子被饥饿诱导•▽-••，但是利福霉素处理都降低其转录□…○…◆△。EspA还含有WxG基序△△●=■•，对于分泌EspA和EsxA/B非常重要□=◇○△。YxxxD/E基序存在于EsxB的C-端柔性尾=…◇○，是分泌EsxA/B二聚体必需的☆◁■▽•，缺失了C-端的EsxB的分泌被阻断△=★△。酵母双杂交实验中△▽-●•，柔性尾与运输机器的组分EccC相互作用◆-■★●…，EccC的C-端可能负责识别含有YxxxD/E基序的分泌信号•●-，赋予该系统特异性△•。ESX-1相关蛋白EspK过去认为是ESX-1活性非必需的▽◆。最近发现•…•□◇▲，MTB的Erdman株分泌EsxA时是需要EspK的▷▽●，EspB的分泌也需要espK•▽•◇☆★。EspK的W-X-G基序是其与EspB相互作用和分泌所必需□□。

　　EspR◆★=:这个转录因子调控espACD操纵子和ESX-1的分泌☆-◆●。最初认为是ESX-1底物△◆，后来发现是不分泌的○◁◆，是更为普遍的拟核结合蛋白(nucleoid-associated protein)◆•□▲…。转录因子EspR具有独特的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)结构和二聚体化所需的C-端功能域△△◇☆。二聚体化的EspR结合相距177bp的2个特异性的操纵基因(operator)位点▷◇○●◆，在espACD操纵子的启动子区域形成环△◁。

　　1□•△○☆■. 膜组分•…◆◇☆:分枝杆菌ESX系统含有5个保守的膜蛋白EccB=●、EccC◇▷▷☆、EccD●◁▪★★●、EccE和MycP◁▷△▼。这些结构大部分都是N-或者C-端亲水•▲○▪◇。除了ESX-4与脓肿分枝杆菌○▷◁，一般缺乏EccE☆◇▽-▼…。用负染和冷冻电镜cryo-EM解析ESX-5和ESX-3复合体的结构•△○▲◁=，发现了4个Ecc膜复合体组分★■-。EccB为准两重对称结构•▷■，位于周质空间●◇▷，具有单次跨膜结构域△◇-☆…，以及延伸的功能域◆▼▪●●●，类似扭曲的螺旋桨▪▽▪◆▪。EccB中央β链之间的二硫键可以稳定结构…□，具有疏水核心功能域■□●，两侧分别是2个重复功能域□○▲★▼◆。结构上虽然无明显相似性…□▪…▪，但是功能与革兰阳性球菌噬菌体裂解蛋白lysin PlycB类似△--◇-●，可能也与细胞壁结合●▼。EccB具有ATPase活性▪…，但其所在的周质空间缺乏ATP○○，这点比较特殊•◇◆△▲▷。ESX-3膜复合体cryo-EM结构的EccB3 N-端与EccC3相互作用•▪•。结合底物和水解核苷酸时▷▪=◇•▽，构象发生变化•▲，诱导EccB周质空间功能域的构象改变▲□•★。EccD有11个跨膜功能域◇=□，在膜组分中疏水区域是最多的◁…▷▲▲●，具有可溶性亲水的N-端功能域○◇◁•★，N-端约110个氨基酸的结构具有泛素样折叠▲◇□，溶液中以二聚体形式存在☆▲。EccD在膜复合体中△▼…◆★，与EccC和EccE的相互作用是十分关键的•□，这也解释了为何敲除eccD5的MTB的ESX-5膜复合体的功能和组装受到影响☆-。EccD可能与孔道的形成有关…△▽▲□，供底物穿过•★■◇•。EccE具有2个跨膜功能域和C-端细胞浆功能域★■◁◇，与糖基转移酶结构同源性低□-○，缺乏结合口袋或者催化位点★▽▼△-■。EccE位于膜复合体的外侧★●，对胰蛋白酶特别敏感▽▷◁==。EccC以二聚体形式存在•…▽-▲○，是硬壁菌T7SS中唯一保守的▷▲▽★◇■，也是关键组分•○◁◁◆△，其N-端含有2个跨膜区-•。这个蛋白具有3个连续的FtsK/SpoIIIE样核苷酸结合功能域(nucleotide-binding domain☆▷●★△，NBD)•★●▽。FtsK/SpoIIIE ATPase家族分子的功能之一是运输DNA▷=-○。FtsK/SpoIIIE ATPase家族分子为六聚体▼▷=•■，这是具有水解ATP能力的状态○●☆，有时受底物调控□…。3个功能域中▼◁，ATPase功能域是系统发挥活性必需的☆▼▪。ATPase活性是蛋白质分泌所需要的◁•▼◆◁，在T7SS中可能发挥调控作用■☆。EccC ATPase活性所需的是解偶联事件•▷●，接头2功能域脱离第一个NBD是NBD1激活所必需的▲☆★◁。枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶MycP在放线SS中高度保守◇▷=-▽▪，为膜结合蛋白△◁，不是T7SS核心膜复合体的一部分…○•-◆▷。MycP1和MycP3晶体结构具有典型的枯草杆菌蛋白酶样α/β结构▽●•▪，其中7个β片层被8个α螺旋包围▷▪△•■，活性位点是天冬氨酸……▪◆、组氨酸和丝氨酸☆▲■•。类枯草杆菌蛋白酶一般具有N端延伸(N-terminal extension)…▽尊龙凯时最新平台登陆专题笔谈 分枝，称为前肽(propeptide)◆•★。前肽阻断了活性位点☆-▼，蛋白酶成熟时◆•◆◁★，前肽被降解▽…○，MycP包含特殊的N-端延伸▽◆■○☆▲，不会阻断活性位点▷▽，也不会被加工▷□□▽，但是这个功能域却被蛋白酶功能域紧密包裹★=▼■，具有稳定蛋白的功能○▪-◆。MycP的作用可能是加工底物□●★▲=。MycP1能够切割ESX-1底物EspB=…●。MycP是ESX分泌所必需的△•，但是其蛋白酶不是分泌必需的=▷△□…□。MycP主要通过与其他组分相对松弛或者瞬间的相互作用稳定T7SS核心膜复合体=●•••●。

　　ESX-3系统的表达增加☆▽•●▽▽。TPR功能域具有12个反向平行的螺旋▷□•，包括蛋白质降解△△▼、信号转导和蛋白质复合体的组装和解体=◁…◇。类似铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)参与组装Ⅳ型纤毛的纤毛蛋白F(PilF)•◇★◇。建模显示ATPase功能域驱动寡聚化为六聚体…-，在不同的培养基中☆=▪•，比全长蛋白质的活性强▼☆★=。

　　分枝杆菌细胞包被(lipid-rich cell envelope)富含脂类◆▲◇○△▲，具有标准的内膜和分枝杆菌特异性的外膜(mycomembrane)▽★◆▪=，可能发挥类似革兰阴性杆菌外膜的屏障功能■▷•…-。枝菌酸是细胞浆膜的第二疏水层★◁○…▽■。生物化学■…、生物学证据表明这层膜类似革兰阴性杆菌的外膜◆▼••●，但不同于脂多糖(lipopolysaccharide•◁■，LPS)外膜•▲☆▲□•。这层特殊的膜可能是趋同进化(convergent evolution)的结果△●■…，也可能是棒状杆菌属持留菌较难控制的结构基础◇○▽☆••，因为该独特结构可以保护细菌在多种环境存活和抵抗感染过程中遇到的逆境△…☆○▷◁，如脱水□=、抗菌酶和机械胁迫■★•。视具体种而异★•◁◁，细胞包被中的特殊脂肪酸——枝菌酸□•…，一般链长可达30～100个碳原子=■◆○▽。该结构的稍微改变可能导致毒力改变■△▽☆▽。分枝杆菌在不影响细菌毒力的情况下◆○◁，是如何分泌蛋白质到细胞表面或胞外▽○●◆○?因此○◇◁=--，分枝杆菌跨膜运输生物分子需要有效的分泌系统◁△-●▷。所有细菌都具有保守的一般分泌途径(Sec)和双精氨酸转位(twin arginine translocation▪◆☆-▲，Tat)转运系统•△△◁。这2个系统具有N-端信号肽…□▷=▪○，在运输过程中被切除○○-☆▼。分枝杆菌脂蛋白信号肽(SecA2)途径与标准的Sec translocon转位系统一起运输部分蛋白•▷。MTB的Sec途径至少包括Rv3240c(secA1)-◆★○-、Rv1821(secA2)=◇○、Rv2587c(secD)•◁□△、Rv0638(secE1)■◇、Rv0379(secE2)☆▽○•◆、Rv2586c(secF)★▪、Rv1440(secG)•■▲、Rv0732(secY)•=。MTB的Tat分泌系统至少包括4个组分•▲●:tatA(Rv2094c)★▲、tatB(Rv1224)•▽▽、tatC(Rv2093c)◁=、tatD(Rv1008)○◆▲▪。Sec和Tat位于周质空间•▪☆-，其他蛋白分泌到胞外▼△◇○。分枝杆菌分泌系统的大部分基因是必需基因…△▪=□▽，类似其他细菌的运输系统◁-▷△▼◇。

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　　MTB北京世系强毒株的ppe38基因发生突变□=△▼，完全阻断PPE-MPTR和PE_PGRS两大类一共80多个ESX-5底物的分泌△…○。回补ppe38基因恢复了强毒株部分高毒力表型■-。缺失ppe38发生在现代北京亚世系演化的分支阶段•▽△，可能与其全球分布和成功有关■●▪。

　　每个ESX分泌机器是多个蛋白质组成的复合体(multi-protein complex)★◁◁，包括保守组分(ESX conserved components◆-■△☆□，Ecc)和分泌相关蛋白(ESX-secretion associated proteins=○▽▪，Esp)☆□•…，以及Esx和PE/PPE蛋白◆○，既有分泌机器的结构组分◇-◁△，也有分泌底物▷…◇▼▼。主要成分是细胞浆和膜锚定的ATP结合蛋白(ATP-binding proteins□▪•；分别是EccA和EccC)•=•▪△▼，以及介导依赖ATP的跨内膜分泌ESX底物的多次跨膜蛋白质(EccB▽•、EccD◇▷•△、EccE)…▷•▲◇…。ESX底物从外膜转位的机制研究较少…▼★，外膜主要是磷脂☆▪○◆▷●。膜锚定的复合物EccE或EccC可能横跨内膜和外膜=-★▽▷，虽然目前关于分泌系统外膜的组分存在还有争议■▼。其他ESX系统的组分包括膜结合的枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶mycosins(MycP1～MycP5)▪★●■。这些蛋白酶可能通过蛋白质水解ESX底物如EspB=-=…▲◇，影响ESX活性▪■-=。ESX的功能至少包括DNA水平转移○▼、代谢物摄取和细胞生理★●▲□。脓肿分枝杆菌(M▽•☆◆=.abscessus)毒力需要ESX-4★◇。上述表型只在快生型分枝杆菌中被发现★▪■◆▲。ESX-5或ESX-5底物参与营养物质的跨膜运输■▽▷-。如海分枝杆菌的ESX-5参与脂肪酸摄取和利用■▪。MTB特异性PE/PPE可能作为选择性通道(selective channel)▼■，供通过分枝杆菌通透性差的膜摄取外源物质☆▲。在低磷酸浓度条件下=▪，MTB的ESX-5相关基因被Pst-SenX3-RegX3系统上调◇◇◁○…。突变阻断合成枝菌酸(mycolic acids)-结核分枝杆菌硫蜡醇(phthiocerol dimycocerosates)和酚糖脂(phenolic glycolipids)或者异源表达MspA孔蛋白porin等增加外膜通透性的事件可以降低海分枝杆菌 ESX-5的必需性○○•△★□。MspA结构类似革兰阴性杆菌的外膜蛋白△•□=▲，可以利用短的β-片层(β-sheet)跨膜功能域横跨外膜▽○★○◇△，形成β-桶(β-barrel)状结构◇▲▽◁☆●。

　　ESX-1在致病菌-宿主相互作用中具有重要作用□▽-◇。ESX-1帮助分枝杆菌从宿主细胞中的吞噬囊泡(phagovacuole)逃离▪▷。MTB及许多致病分枝杆菌甚至能够表达完整esx-1的BCG●•▪••:▲◆:RD1重组菌…-，可以从被感染巨噬细胞或树突状细胞的吞噬体中转位到细胞浆(cytosol)◁-…□，而ESX-1缺陷的菌株被限制在囊泡中□☆，并且毒性比野生型小▽△●▷，这可能是ESAT-6与生物膜相互作用的结果▲◁●□。完整的ESAT-6的 C-端可以破坏巨噬细胞的吞噬体•◁•◇，并且有利于肉芽肿的形成•-●★▽。这种相互作用是否需要CFP-10或其他蛋白仍未知•□▲□。致病分枝杆菌和非致病分枝杆菌的ESAT-6在构象变化方面的能力似乎不同▽▪…。目前不知道EspACD区编码的蛋白质是否也参与了破裂含有致病分枝杆菌的囊泡这一过程▽☆…▲。ESX-1对感染过程中分枝杆菌的几个关键特征的影响巨大=★•-□▲。MTB和BCG基因组水平同一度(degree of identity)高达99□▲△△=.9%★••△◁=，而BCG缺乏ESX-1的RD1区域△•☆□◁•，BCG疫苗在多个方面的功能不全-◆□:细胞之间扩散▪◇-=、细胞凋亡…●、自噬诱导或破坏自噬☆▷☆■-、激活NLRP3炎症体(inflammasome)☆▷▪、诱导Ⅰ型干扰素□○▪、CD8 T细胞应答…•=◁▷。这些差异可能都与BCG缺乏RD1区▼■-▲，丧失与细胞浆的接触有关▼▽。BCG◆◇◆•▽:◁…▽▷:ESX-1重组菌株的表型类似MTB…◁，包括可以诱导宿主细胞死亡◁•▼●△☆、在动物感染模型中的毒力增强•□△=△。当然○▽◇…-，多次传代而来的BCG可能也积累了许多其他减毒突变■★▽。

　　MTB致病关键毒力因子如EsxA及其蛋白质伴侣EsxB的分泌依赖于ESX-1分泌系统▼=。ESX位点得名于第一个被鉴定的分泌底物EsxA●★○•★★。EsxA属于WxG100蛋白家族▪…▪▼★。WxG代表2个保守的氨基酸□■■•▲:色氨酸和甘氨酸◁△•■◇，中间是其他氨基酸■=。该家族的蛋白平均大小约100个氨基酸■▪▽。ESX-1系统的底物EsxB也属于WxG100家族▪△▪▪…。EsxA可能具有双功能▼☆…，既是分泌底物▪…=◇◁，也是分泌机器的组分-◁。EsxA和EsxB形成异二聚体•▼…●，以折叠形式分泌☆=▷▼□。金黄色葡萄球菌的T7SS分泌的WxG100是一个Esx蛋白▽▽□，形成同二聚体▲◁。

　　ESX-1分泌系统的EspG1分子伴侣与T4溶菌酶融合◁▷◆☆。EspG1为准二重对称…▲，中央具有β折叠★○，2个 α螺旋束•▽□▼。

　　除了ESX-1•-▼◇□▼，其他ESX系统也影响致病分枝杆菌的存活和毒力▼•…■◁。如慢生型分枝杆菌中的海分枝杆菌和MTB存在的ESX-5系统▽◆▽。利用MTB和海分枝杆菌 ESX-5失活突变菌株也证实○▽◁◆，ESX-5确实负责分泌ESAT-6/CFP-10旁系同源分子(paralogs)EsxN/EsxM和PPE/PE蛋白☆▲。完整的ESX-5系统是MTB体外生长和完整毒力所必需的★▲。缺失eccB5-eccC5片段的MTB无法正常生长■△□●•。缺失膜通道EccD5的突变菌株不能在固体培养基上生长▼☆，但不影响在液体培养基中的生长=▪=，并且导致细菌毒性持续减弱▷★○-。ESX-5对海分枝杆菌和MTB PE/PPE蛋白的分泌影响很大=•◁。在利用ESX-5突变菌株和野生型MTB感染C57BL/6小鼠生物模型中=★◆■，也观察到类似现象■■。ESX-5突变菌株不能分泌PE/PPE蛋白•◆，因此☆▪☆，宿主也缺乏针对ESX-5相关的PE/PPE蛋白•▲■•，如PPE25☆=■=、PE18▷▲●、PPE26◁▷△•▽□、PPE27和PE19的T细胞应答=…☆▼-■。结果发现◆▪●●▽•，ESX-5介导的分泌是触发T细胞应答所必需的•-•，类似ESX-1分泌蛋白▼=■△。ESX-3系统在分枝杆菌中非常保守●○▼○=，可能控制铁和锌的摄取•▽◁-…□。除非失活铁外螯合素途径◁=，耻垢分枝杆菌的生长是不需要ESX-3基因簇的◇▲□，而MTB体外生长则必需此系统▪▲☆◁=▼。因此•▽-，MTB必需的ESX-5和ESX-3系统也作为结核病新药物的靶标□•△△●。

　　ESX-3分泌系统是分枝杆菌维持铁稳定所必需的○●★，其中包含细胞浆组分EccA3和细胞膜组分EccB3○●▽☆▼、EccC3▼•★、EccD3★△-●、EccE3及MycP3▲•▼■□☆。荧光标记法发现▪=，EccA3定位在耻垢分枝杆菌细胞的一端▷▷☆。缺失ESX-3不影响荧光标记EccA3的亚细胞定位●○=…◆◆。亲和纯化质谱发现◁•▽，与EccA3一起纯化的分子包括-▪★▪:脂肪酸代谢(FAS=•▲、FadA3▷○▪、KasA和KasB)=○▲☆-◁，枝菌酸合成(UmaA-△=▪、CmaA1)□☆，细胞分裂(FtsE◁◆◆、FtsZ)▽△○，细胞形态和细胞周期(MurS○▽◆◆◁◆、CwsA和Wag31)▷…▷，分泌系统相关蛋白(Ffh△□☆◁、SecA1■=、EccA1和EspI)•-=●。

　　2◆•▼. MycP▼★…□▷…:MycP是ESX膜复合体中唯一的保守膜蛋白▷◇□-，且不是ESX-5膜复合体的组分▼▼。MycP是subtilisin-like蛋白酶-•，具有经典的信号肽序列■▷，具有周质空间蛋白酶功能域-••▪▽，以及C-端的跨膜区▼△▽▷•，与细胞包被结合-•。这些蛋白酶在不同ESX系统中发挥关键作用★★▲。但是在分泌过程中的作用未知▼▪●▲▪□。MycP唯一已知的底物是EspB▷○△☆▲•。MycP参与底物加工▷☆，而经典ESX底物如Esx蛋白▪•▪◇◁，在运输时不被切割■□▷▲。MycP的蛋白质水解活性不是分泌必需的☆○▪★，但是mycP1缺失导致底物不能分泌=□•▪▪，而催化功能失活的MycP1能够支持分泌ESX-1底物◇◁•☆=，甚至比野生型的分泌量更高…●○●。因此•△○●☆•，推测MycP具有双功能作用尊龙凯时最新平台登陆-▷▲●，分别是底物加工和负调控分泌◁▼☆◆。耻垢分枝杆菌和抗热分枝杆菌(M-▷.thermoresistibile)的MycP1结构具有典型的枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)核心功能域•▽=△▽-，具有几个外展的环▲○•，且N-端具有独特的延伸▷◆◇▽。subtilisin一般具有N-端前肽★▪▷，其作用是防止底物进入活性位点○▽◁，但MycP的N-端延伸与subtilisin前肽序列无同源性•△◆…◇●。MycP1结构提示N-端延伸包裹在蛋白酶功能域▽=，不阻碍或封闭活性位点△◆□◁○…。具有完整N端延伸的MycP1可以体外切割EspB★•○…，虽然效率较低▼■。耻垢分枝杆菌的MycP3结构具有类似的折叠和N端延伸…▲，构象类似MycP1结构……。MycP结构的折叠类似■□★▽▼…，活性位点裂缝的表面性质不同●-，不同的MycP之间大约有45%的序列一致◆◁▽■，MycP1和MycP3的底物特异性不同◆▲△▲•●，MycP特异性在分泌中的作用还有许多值得探索的地方…△★。如其他MycP的底物☆○•□?MycP与ESX机器的其他组分如何相互作用★△…?这些蛋白酶可否作为药靶■◇◁•▪?这些问题的回答▽▪，有助于认识T7S机制▪△▲◇▲。通过构建海分枝杆菌的MycP1和MycP5融合分子▪◆▲…，比较融合分子对ESX-1和ESX-5分泌的影响☆◆☆••●，研究稳定膜复合体所必需的功能域•▷◁，发现蛋白酶功能域△▪、跨膜功能域都是ESX系统特异性功能所必需的•★▷▽-■。

　　通过分析结核分枝杆菌复合群(MTBC)株系3▲■◁☆□、4☆▼▼=-◁、5和7的蛋白质组▽•◇▪○，推测毒力和其他生理特征的演化发现▷▷▼=…▽:株系7中有些蛋白质丰度降低○◁★▪■，如参与DNA损伤修复◆•▽…▼●、Ⅶ型分泌系统的ESX-3和ESX-1的蛋白质◆◆。

　　ESCRT-Ⅲ蛋白质被招募到膜损伤处▼●•◆▲。ESX-1▼…▽、ESX-4和ESX-5相互作用★…◆■，分泌ESX-1和ESX-5底物需要EccA1和EccA5▪▪•…=□，其分泌需要T7SS的协调作用▷■▽▲□▼。

　　细菌分泌系统对于细菌的发育☆•=△◇▪、种内和种间竞争☆△、营养获取◇◁■…、毒力•◇•、生理☆○、遗传…▷、生态都非常重要◁▼◁◆▲。细菌利用分泌系统将蛋白质分泌到细胞外△△，也是细菌适应生境所必需的▼★▽。分枝杆菌Ⅶ型分泌系统及其底物与结核分枝杆菌致病密切相关▪•☆，笔者将对Ⅶ型分泌系统的组成□☆•■◆◇、结构=☆▲▽△、底物和功能进行介绍△◁▽•★•，尤其是与宿主相互作用中的功能◁■•-，以期为研发结核病新的控制措施提供基础☆○•●▼★。

　　靶向T7SS的药物研发具有良好的应用前景▪=。通过对靶向ESX-1毒力因子的药物进行高通量筛选(high-throughput screen▲•▪，HTS)▼●••-○，可以抑制ESX-1分泌的分子-•★■☆▪。测试指标是分枝杆菌存活率和细菌毒力是否降低☆•=□△■，并用分枝杆菌蛋白片段互补分析耐药机理△○○★▽。结果发现化合物IMB-BZ间接或者直接阻断CFP-10-EccCb1相互作用☆★◁△，从而抑制CFP-10的分泌□◁▽☆=。

　　一些ESX底物的调控可能更复杂●△▽◆，MTB的操纵子espACD上游一般有1▽△○□.5kb的基因间区域△◆-。许多调控因子结合espACD启动子并影响其表达▲△，包括EspR▪●▷、MprA▲★◆、CRP和Lsr2○•。这说明该操纵子受到多层次复杂的严格调控◁•■■●▲。T7S底物一般不会因为分泌系统被阻断就积累在细胞中▽▷☆。不同的ESX系统和不同的突变均如此●▽○-◇。这是底物调控的反馈机制□▼●▽▲=。转录起始与此调控无关■▷◁△…，可能与RNA稳定性●△、蛋白质翻译起始/蛋白质稳定性有关-▷▽◆●△。这些底物分泌相互依赖△•-。

　　促进膜修复△○□=•。CpnT运输和到达细胞表面需要ESX-4•○-▼，这个反应就在几分钟内完成★◁，但尚需证据★•★□◇=？

　　espACD基因簇位于基因组的其他地方•◆…▽◇■，是MTB的ESX-1分泌所必需的▷…◇☆•，在海分枝杆菌▽=▪、麻风分枝杆菌和坎纳分枝杆菌中保守★☆△=○。espACD基因产物(ESX-1相关的EspA★▲◁☆、EspC▼■★▲□=、EspD蛋白)分泌与ESAT-6和CFP-10一样相互依赖(如EspA和EspC)▼▷▷，而不是ESX-1另一个底物EspB◆▷□◇。其他Esp蛋白■◁○◁◁○，如MTB的EspF1或EspG1不影响ESAT-6/CFP-10的分泌▼★，但为毒力所必需▪■。espACD簇受到几个主要转录激活因子如PhoP▲△■•★★、EspR和(或)MprAB的调控▲◇▷。海分枝杆菌和麻风分枝杆菌中存在espACD簇的直向同源分子-□•，但在含ESX-1的快生型分枝杆菌如耻垢分枝杆菌中尚未发现□=▷▪，耻垢分枝杆菌的ESX-1系统主要负责DNA接合转移(conjugational DNA transfer)▼☆▪△=■，而招募来的EspACD主要发展为蛋白质分泌系统◆□▲，与细菌毒力相关▽=△○。espACD位点可能在慢生型分枝杆菌中进化而来○□，或者被转移到部分慢生型分枝杆菌▲-○■，赋予ESX-1系统新功能▪▽=•▼○。

　　IdeR◆▪◁:ESX-3受铁和锌依赖性转录因子ideR和Zur(FurB)调控□■▪◇▲★。培养基中加入铁螯合剂可以上调esx-3系统的表达■■。缺铁时◁▲…○，分枝杆菌生长必需ESX-3■…◆••□。这可能与ESX-3经分枝杆菌素摄取铁有关△◁▷•=◁。高锌离子浓度时-●▷○△…，ESX-3可有可无■==▪。这也说明摄取分枝杆菌素并非ESX-3的唯一功能•○•=。Esx-3位点编码的EsxG和EsxH以异二聚体方式分泌▷●•◆，是确证的ESX-3底物△▼…☆◇。Esx-3位点编码的PE5和PPE4可能是ESX-3的底物▷▲•。

　　经T7SS的分泌不依赖宿主信号或者接触宿主细胞■•◆，EccA结构保守•▷=▽，CpnT是NAD+糖苷酶(glycohydrolase)☆▪▷▼，ESX-1★★•▪、ESX-3和ESX-5的Esx蛋白一般也会分泌△●▽◇•，也是目前已知唯一的MTB分泌性毒素▪=。ESX-5系统及其分泌底物PPE10是维持鱼致病菌——海分枝杆菌细胞壁完整性所必需的■★□★•☆。因为在上清液中未见其分泌产物▪-◆◁■。杀死被MTB感染的巨噬细胞△…。所有esx位点都存在eccA▽▽□▽▽。参与蛋白质-蛋白质相互作用▽◆■☆□。

　　PE/PPE…□□▷☆◆:T7SS底物中最丰富的是PE/PPE=◁，MTB基因组有编码能力的占10%▼△=■，约169个pe/ppe基因□☆-■。PE/PPE得名于其N端保守的脯氨酸(proline▲◇★□，P)和谷氨酸(glutamic acid▼☆○=□■，E)基序▷○•◁。除了esx-4…-•▲◁，其他esx簇都含有pe和ppe基因★=○，但是大部分PE和PPE底物不是esx位点•◁◇■。大量PE和PPE蛋白质缺乏伙伴蛋白(partner protein)☆◁▲▼▪，分泌的时候△▼◇，是单一蛋白质分泌=▷★-★?还是与未知的伙伴蛋白以异二聚体方式分泌◆★?许多PE和PPE蛋白含有大片段的C-端延伸◆■，如功能已知的负责降解长链三酰基甘油的酯酶LipY-◁☆。MTB的LipY含有PE功能域…☆▷••，海分枝杆菌的LipY含有PPE功能域•◆△•…◁，浅黄分枝杆菌(M▲•…◁•■.gilvum)的LipY含有经典的信号肽▲▲。PE和PPE的信号序列可以相互交换○●，不影响经T7S分泌到细胞表面◁▲，但是▼▪，如果替换经典的分泌信号▪▪▪▼▲，则不能分泌到细胞表面•▲=◆■。PE/PPE的分泌伙伴◁□▷▪☆、折叠▪○▽□▲•、分子伴侣及功能还需要更多的研究去了解△△…○=。

　　在培养基中●◇□-◁，ESX-1系统也是活跃的▼■•▪。多个因子调控ESX-1的表达☆■…★▷，如双组分蛋白激酶PhoPR系统●•▷=•。增加Cl-浓度或者降低pH值会激活PhoPR系统□▪●。PhoP调控espACD位点▽▼■○，间接调控ESX-1分泌★•▽。

　　在缺失esxG或esxH的MTB菌株中▪▪，体外培养需要额外添加铁□■☆•▪，并且体内毒性降低△◇□▽☆。在感染的小鼠中◆▪，分离到esxG或esxH的MTB突变菌株的阻遏突变(suppressor mutant)-▼■●，阻遏突变菌株在体内生长的数量多○▽★-◇，并且毒力功能恢复★▷…•◇△。阻遏的原因是ESX-3旁系同源区域(paralogous region)的表达增加○△…☆-。该区域缺乏分泌机器的编码基因=▲■，但是能够编码ESX-3的孤儿底物(orphan substrate)EsxR和EsxS◆★。这些区域编码的产物可以互补esxG或esxH的缺失…▷▼★▪○。在机制上▽◇，破坏了转录阻遏因子★▷□，基因的表达量扩增了38～60倍★○-▽□。这也提示MTB的染色体类似手风琴(accordion-type)折叠式扩增△-★●。

　　T7S底物如何被识别▼■★?系统的特异性是哪些因素决定的=●=▼?ESX/T7S底物有何共性=○?这些方面目前已有不少研究▲•◆☆▷。

　　解析了耻垢分枝杆菌 ESX-3嵌入膜中的核心复合体结构▪…■，发现EccB3-•■、EccC3=▪▼△☆、EccD3和EccE3按照1▼…-■:1▲…=▲:2•□◆▲:1的化学计量比例-▼☆▪●，形成2个相同的原体•◁。EccC3偶联蛋白具有柔性的4个ATPase功能域阵列☆▪△◇☆○，通过茎功能域(stalk domain)与膜连接▼●•☆★…。邻近茎结构的功能未知结构域(domain of unknown function…▷○，DUF)是分泌必需的ATPase的功能域▷★◁。EccB3主要在周质空间▽••，具有一小段跨膜区域•◆△□•，能够接触茎功能域▽◇◇◆▽…行90后奶爸眼中的品质生活是什么尊龙凯时人生就博登录风行游艇，。当底物分泌到周质空间时•●▷-，与茎功能域偶联区域的构象发生变化▼★。后者被EccC3远端的底物结合…☆•◆◁，随后DUF的ATP水解启动◆▲。此外◁•，目前还解析了MTB完整的ESX-5 T7SS内膜复合体(inner-membrane complex)的结构▪▪杆菌Ⅶ型分泌系统的结构、底物与功能，大小为2▼▪-◆☆.32MDa◁★△◇，具有165个跨膜螺旋•★◆■▲。MycP5三聚体盖住中央周质空间穹顶样腔(central periplasmic dome-like chamber)□△-=△▼，蛋白质水解位点面向空腔•▪▼▲○。空腔是中央分泌和加工通道★△◇。缺乏MycP5的复合体不能在周质空间进行EccB5的组装•■●△◆。这提示MycP5对于复合体的完整性非常关键■▪。在EccB5-MycP5腔下方▷▽◇，EccC5的ATPase二聚体组装为三束★☆•，每束有4个跨膜螺旋…☆-。三束一起封住中央分泌通道◁▼==。细胞浆中EccC5的每个功能域具有2个不同的构象▪▷★☆△，可能是处于不同的分泌状态▪•○。

　　海分枝杆菌 ESX-1系统的底物EspE和EspF经WhiB6负调控基因表达…•▲。ESX-1底物在分枝杆菌胞内和胞外具有双重功能◇◁▼。在胞内■□▼◇▲，EspE和EspF负调控esx-1基因表达☆=，而细菌的毒力需要这2个分子-▽△…★•，且不依赖EsxA和EsxB促进裂解活性○…□。

　　协同分泌一个底物◁◆。不依赖钙离子和招募ESCRT-Ⅲ□●。ESX-2和ESX-4不同=◆○△◇◁，也不能刺激先天细胞因子的产生…◁▲■•。

　　1▪▼◇■◇▼. 亚细胞定位•★■…▲●:T7SS在分枝杆菌细胞中★•■，定位何处△=△▪?免疫荧光(immunofluorescence)在分枝杆菌中定位比较困难□★-★▼■，因为其细胞包被渗透性弱★☆◇○▽=。免疫标记新合成的ESX-1底物EspE定位在细胞表面•-，以及海分枝杆菌突变菌株的细胞包被渗漏导致ESX-1系统中带有免疫标记的EccC出现在细胞的一极▷○☆○•。极性定位在其他研究中也得以证实▲◇，如耻垢分枝杆菌的ESX-1蛋白与黄色荧光蛋白(YFP)融合出现在细胞一极△△▷▪◁=，但YFP融合蛋白是否功能健全未知▼☆□★。其他ESX系统是否极性定位也未知=◁▪。

　　转录因子whiB6(Rv3862c)•△-■▽▼:这是PhoP调控单元(regulon)的组分△△▼，基因组结构上靠近esx-1基因簇◁•▽-▪。临床MTB菌株中▽••▼•，PhoP结合whiB6的启动子区★□▼•★●，诱导后者转录◁○▲□=。增加的WhiB6正调控几个esx-1基因的表达•=◁▷☆◆，从而促进了ESX-1的分泌◁•★■。实验室菌株H37Rv和H37Ra的whiB6启动子区点突变导致PhoP对whiB6的调控变换▼◆▪◆•，PhoP负调控ESX-1的分泌…■○◁…。缺失ESX-1功能的海分枝杆菌感染巨噬细胞时□•-□▽▽，espA操纵子的表达水平增加▲•=•。而在体外培养时-=▽●○▼，海分枝杆菌下调了ESX-1底物表达=○…◆，但不影响ESX-1结构组分△●◇。海分枝杆菌和MTB都有这种表型▷★。whib6的调控☆□○▷，下调ESX-1底物•▲▪◆。ESX-1相关的PE35/PPE68蛋白过量表达导致ESX-1底物EsxA的分泌显著增加☆☆-▲。这提示这些蛋白质之间具有相互作用▼•△。MTB的WhiB1△○: NO应答性Wbl蛋白质(1970年发现的放线菌铁硫蛋白)是sigma A形成复合体所必需的◇=▲▷，NO相互作用使得复合体解离(亚硝基化)◆▷▪。C-端正电荷残基可以与DNA结合○…★=，重编程基因表达-•，诱导ESX-1系统表达■•△▲▽。

　　Pst/SenX3-RegX3…★▽=▽▷:这个系统可以感知磷酸饥饿情况★▪☆◁，然后激活ESX-5○★★•▽。MTB在缺失pstA1(编码磷酸转运蛋白)后▽■，RegX3会被组成性激活•★▼◇=△，可以分泌更多的ESX-5底物★★■。RegX3的突变菌株感染小鼠后•◁，毒力降低▼…□□。DeltapstA1缺失菌株会引起ESX-5底物EsxN的分泌增加△☆▼▲○▪，RegX3的esx-5结合位点缺失或者突变○●▲□，可以逆转这种趋势◇▪，同时也会消除缺少磷酸引起的esx-5分泌增多现象▼□，在Irgm1-/-小鼠中细菌的毒力也增加…▲□•△。在NOS2-/-和C57BL/6小鼠中=★，缺失菌株的毒力不变□▼■-▼●。这提示还有ESX-5系统外的因素参与缺失菌株的减毒☆★▼▪•▼。ESX-5是分泌MTB毒力所必需的★○▪◁，但也受到紧密调控◇▼▷-•，避免被宿主免疫应答清除•◇▷•。

　　天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease)PecA□◁◁=:该蛋白酶本身也是T7SS的底物…▲★◁，负责将PE_PGRS蛋白的N-端100个氨基酸PE功能域在细胞表面处切除▽…▽•。蛋白酶也会自我切除…■☆☆▼=。在敲除pecA的海分枝杆菌中•=•◁★，细菌的毒力降低◆◇●•。

　　ESX位点中最短的是ESX-4▼…▪，也是Mycobacterium属中最古老的ESX…◆•△◆◇。其他ESX位点似乎源自ESX-4样系统的基因重复▲▪▷-，以及插入额外的基因○■▷○□★。如插入pe和ppe基因●▷。这些事件可能发生在ESX-1分化时和分化后▼•■。ESX-1位点的pe和ppe基因是该家族的祖先成员-●▷◆，在MTB中扩增△◆，高达基因组编码能力的8%△■=▽，PE和PPE蛋白是宿主免疫系统识别的重要免疫原◁◁●。ESX-1在MTB和坎纳分枝杆菌(M◁☆=…•.canettii)中高度保守•◁•…▷▽，可能是致病所需○○▪•■。许多分枝杆菌也丢失ESX-1位点▪•◆，包括致病的分枝杆菌▷▲，如鸟分校杆菌(M▲▼-.avium)和溃疡分枝杆菌(M▽□○▪…▼.ulcerans)☆…△○☆□。这提示ESX-1的底物可以被其他分子代偿▼▲▽-☆•。例如○●○■，溃疡分枝杆菌分泌的毒素mycolactone•▷▽○•，鸟分校杆菌产生的糖肽脂(glycopeptidolipid◁■-▷•，GPL)对巨噬细胞有毒性◆○△，可以代偿ESX-1底物的功能▽▪★-。

　　未受到严格调控△☆△。ESX-3系统受Zur阻遏子调控•□▪▪◁，ESX-4的esxTU底物被SigM转录调控因子控制▷■△，TNT)•…◆□▽▪，将遗传方法和高通量方法结合•••▼，CpnT胞内分泌依赖ESX-1和ESX-4★▪。TPR)基序-•=…○▽。

　　不同培养基中•…◁，可能在特定条件下产生▪○☆◆。还具有多种功能▲▷○▪◆▲，不能再分泌=◁▼▲◁-。espL敲除菌株不能在胞内复制☆▪-…△▪。

　　CpnT的分泌基序被破坏后◆◆•□，EccA同源分子只在编码PE/PPE底物的系统中存在▪-▲•●■，在细菌●◆○▽●、古菌•…△●、植物和哺乳动物中保守的TPR功能多样•▪。体外表达的ATPase功能域活性很强▷▽，TNT进入细胞浆▲◆◁★…=，T7SS)与致病菌-宿主的相互作用■☆•☆◇、致病菌进化及毒力密切相关▲=•◇。如Rhodococcus☆=□○■、Corynebacterium和Nocardia▽…=☆•★！

　　2◁★-. 特异性分子伴侣▲●●:分子伴侣可以是共同的▲○，也可以是特异性的▪…△□。其作用是防止蛋白质聚集□★，引导底物到转位机器◇●○△。

　　ESX底物的产生和调控差异很大●□•△…◁。EspL也是分子伴侣○=★▼△，类似pe△◆、ppe和espG基因▼=•，这点与其他分泌系统不同▼▼=◆◇★。海分枝杆菌的ESX-5系统是体外培养或感染巨噬细胞时分泌CpnT所必需的•★-★。MTB的EccA1 N-端结构为右手超螺旋(right-handed superhelix)…◁○，具有分子伴侣活性■●■○，含有6个串联的氨基酸重复(tetratrico-peptide-repeat===■◆，EspE▽□□、EspF和EspH是致病菌-宿主相互作用的毒力因子◁▽▽▲▪。许多放线菌(actinobacteria)都存在Ⅶ型分泌系统○•！

　　分枝杆菌基因组鸟嘌呤和胞嘧啶含量高达66%•◁▽▲△，属于放线菌□☆=◆●，广泛分布于环境中•▷△★•▷。大多数分枝杆菌是不对人类致病的腐生菌(saprophyte)◇…•□•◁，如大多数的快生型分枝杆菌•…•▼▪。少数对人类致病★★▲◁，如脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)○◆。慢生型致病菌较少…=□▲▽，包括结核分枝杆菌(MTB)和麻风分枝杆菌(M□□…….leprae)★-□●。